智能“金创药”——绿茶提取物制备的驱动水凝胶用于治疗糖尿病慢性伤口
汇报人：硕士研究生二年级朱耀萱
西安交通大学成一龙教授课题组研究了一种以EGCG为主药的智能水凝胶，用以治疗糖尿病慢性伤口。相关文章GreenTeaDerivativeDrivenSmartHydrogelswithDesiredFunctionsforChronicDiabeticWoundTreatment于年2月发表在AdvancedFunctionalMaterials杂志上。
糖尿病是最常见的代谢性疾病之一，其中约有19%-34%的患者会患兼患其并发症——慢性伤口。正常状态下，发生损伤后，首先血小板聚集、血栓形成，白细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）迁移到受损部位，向周围组织释放生长因子。然后肉芽组织向伤口内生长，其中主要包含了成纤维细胞、更多的巨噬细胞和新生血管。表皮细胞迁移加速，并覆盖新生组织。但当存在异常病理因素或微生物时，伤口愈合过程被打断，伤口无法愈合，变成慢性伤口。
慢性伤口的病理生理学过程见下图。糖尿病患者持续高血糖，许多重要蛋白质的非酶糖化反应增强，导致细胞和ECM功能异常；动脉血循环障碍则导致组织缺血和缺氧，甚至坏死。细菌大量定植于伤口床可以形成生物膜，对细菌等微生物形成保护，使巨噬细胞和抗生素无法发挥作用。“绝望”的巨噬细胞会释放大量的蛋白酶和毒性氧自由基，造成组织细胞、细胞外基质和生长因子等的损伤，并发生持续的炎症反应。慢性伤口中肉芽组织发育障碍，表皮细胞也无法迁移，伤口愈合停滞，形成慢性伤口。理想的伤口敷料应该在药效和安全性好的基础上，兼具良好的机械强度和自修复能力，以满足对慢性伤口的治疗目的。
●研究内容●
水凝胶的制备及相关力学性能测试
绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），其本身具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老和抗癌等活性，但生物利用度低、代谢速度快。将其制备为水凝胶用于创面可以扬长避短，充分发挥其优势。本文中作者采用动态共价键交联法，制备可逆共价键硼酸酯键。与传统共价键相比，动态共价键更加稳定，不容易被破坏，且其可以在温和的条件下实现凝胶-溶胶的可逆性转化。●●●图1（a）EACPA水凝胶敷料制备过程示意图。（b）水凝胶粘附在作者的皮肤上。剥落后未发现残留物，可见其具有足够的粘合性。c）显示EACPA水凝胶的自修复能力，可以承受外力的大力拉扯。
首先用EGCG和3-丙烯酰胺基苯硼酸（APBA）以1：2的比例混合，制备成E-A复合物作为动态交联剂，然后与丙烯酰胺（AM）共聚，加入催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂四甲基乙二胺（TEMED），形成三维网状结构，发生溶剂-凝胶的转化，制备得到水凝胶EACPA（图2a）。扫描电镜下可见该凝胶多孔，说明其具有良好的透气性（图2b）。图2c中，降解实验刚开始时各组受试凝胶均有一个溶胀过程，该过程有利于在伤口上吸收组织渗出液；且可以看出，交联剂浓度越高，交联密度越大，降解越慢。
EACPA水凝胶有着良好的机械强度和自愈力。如图2d，挤压、扭曲和弯折等外力作用后，仍可恢复原形。并对含不同浓度交联剂的水凝胶进行了拉伸测试，结果见图2e，交联剂浓度越高，拉伸应力越大。以上表明E-A复合物作为动态交联剂制备的水凝胶兼具韧性和柔性。
●●●图2EACPA水凝胶的形态学，降解谱和力学表征。
a）凝胶化进展的光学图像。E-A复合物的混合物在室温下以溶胶状态呈现，在添加APS和TEMED后它经历了溶胶-凝胶的转变。b）具有9mmE-A复合物的EACPA水凝胶的SEM图。c）在37℃（n=3）的pH7.4柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中的EACPA水凝胶的降解谱。d）具有9mmE-A复合物的EACPA水凝胶的原始，压缩，恢复，弯曲和扭曲形状。标尺：1厘米。E）具有不同交联剂含量的EACPA水凝胶的拉伸应力-应变曲线。f）机械性能概述。
图1c中宏观的自修复能力来自于微观上硼酸酯键的重排（图3a）。图3b模拟了使用中如若遇到敷料破损的情况，可以看到被切成两块的敷料接触30秒后，愈合的水凝胶可以承受手指的前后弯曲。用流变学研究来评估EACPA水凝胶的自愈合行为（图3c）。应变从1%切换至%，五个循环，弹性模数未发生显著变化，表示EACPA水凝胶具有良好的自修复力。作者进一步进行了应力-应变试验以测定自修复效率。首先用刀片将EACPA水凝胶切成两部分，然后在裂缝表面上聚集在一起进行不同时间进行拉伸实验。图3d显示了EACPA水凝胶（9mmE-A复合物）在室温下没有任何刺激30秒、3分钟和10分钟愈合的应力-应变曲线。接触时间越长，硼酸酯间重排得越多越好，水凝胶修复率越高，拉伸应力越大，断裂伸长率越大（图3e）。抗拉强度在接触10分钟后可完全恢复。并对愈合的水凝胶（接触10分钟后）在新的部位进行了抗拉试验，结果表明形成了坚固的愈合界面（图3f）。作者还希望EACPA水凝胶应在不同表面上具有先进的粘合能力，图3g可以看到其对新鲜猪肉片也表现出理想的粘合性。还对猪的皮肤组织、猪的肌肉组织和玻璃进行了测试，结果见图3h。
上述结果表明，EACPA水凝胶具有良好的机械强度和自修复能力，可以使水凝胶敷料能够完全覆盖伤口部位，承受各种变形和损伤，并防止继发感染。
●●●图3EACPA水凝胶的自愈和组织粘合性能。
a）EACPA水凝胶的自我愈合过程的插图。b）宏观观察EACPA水凝胶粘附在手指上的自愈效果。c）含9mmE-A复合物的EACPA水凝胶敷料在1％至％的张力之间的五个循环的G’和G’’。d）在室温下愈合30秒，3分钟和10分钟后水凝胶的拉伸应力曲线。e）分别在室温下愈合30s，3分钟和10分钟后EACPA水凝胶的自我愈合效率汇总（n=5）。f）在室温下愈合10分钟，EACPA水凝胶的拉伸试验的照片（红色圆圈是水凝胶的切割位点）。g）粘附到新鲜无骨猪肉板的图像及EACPA水凝胶的伸展性。标尺：10毫米。h）EACPA水凝胶对猪皮肤组织，猪肌肉组织和玻璃载玻片（n=5）的粘附强度。
安全性评价
作者通过MTT法、活死细胞染色以及溶血实验对EACPA水凝胶安全性进行评价。图4a可见，不同浓度的水凝胶处理24h的L细胞，细胞活力均在90%以上。使用活/死染色视觉上直观观察细胞死活情况，其中活细胞和死细胞分别用绿色和红色荧光染色，图4b可以看到大多数L细胞呈现正常形态。补充信息中（图S-10）用小鼠红细胞评估EACPA水凝胶的溶血情况，结果表明，对于所受试的红细胞，水凝胶的安全浓度范围为1-50mg/mL。
●●●图4（a）用不同浓度的EGCG-hydrogel处理24小时的L细胞的细胞活力。（b）分别用EACPA水凝胶处理1,2,3天的L细胞的活/死细胞染色图。标尺：μm。S-10）不同浓度EACPA水凝胶的溶血率。
体外活性评价
体外实验分为抗氧化、抗菌和抗炎三个部分。
01
抗氧化部分
EACPA水凝胶可以很好地清除DPPH，且具有浓度依赖性（图4c）。用Rosup试剂对L成纤维细胞进行处理，刺激细胞内产生过量的ROS。用DCFH-DA用作检测ROS水平的探针，其产生的绿色荧光强弱与ROS含量正相关。如图4d所示，在用10mg/mL水凝胶处理的L细胞中可以观察到明显的荧光猝灭，荧光强度与对照组相似，表明EACPA水凝胶具有很好地清除ROS的作用。
02
抗菌部分
作者选用了革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌进行实验。先将不同浓度水凝胶与两种菌液37℃下共孵育6h，然后进行平板涂布，继续37℃培养12h，以PBS作为阴性对照，拍照观察抑菌情况（图4e），并通过菌落数定量计算杀菌率（图4f）。从结果可以看出其对两种受试菌种具有良好的抑菌作用。
03
抗炎部分
巨噬细胞中有经典巨噬细胞M1型，其主要产生促炎细胞因子，具有很强的杀死微生物的特性，但是这些特异也容易引起组织破坏。而M2型巨噬细胞主要负责免疫调节和组织重塑。在慢性伤口中，我们希望有更多的M1型巨噬细胞可以转化为M2型巨噬细胞，从而有利于创面愈合。LPS刺激的RAW.7巨噬细胞促使其分化为M1表型，用作阳性对照。RT-PCR分析结果表明（图4g），与无水凝胶处理组相比，EACPA水凝胶处理后可以显着下调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和白细胞介素-1β（IL-1β）含量（M1标志物），相对上调M2表型标志物的表达（CD,CD和Arg1）。此结果提示，EACPA水凝胶通过促进M1表型对M2表型的转化来调节巨噬细胞的募集，有利于伤口愈合。
●●●图4c）不同浓度水凝胶对DPPH的清除能力。d）用DCFH-DA染色Rosup刺激细胞观察ROS含量的荧光图像。标尺：μm。e）分别用PBS和EACPA水凝胶（5,7,9mME-A复合物）处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，然后平板涂布的结果（n=3）。f）EACPA水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率（n=3）。g）RT-PCR测定EACPA水凝胶对LPS刺激的RAW.7细胞CD，CD，ARG-1和IL-1β表达的影响。与对照组相比，##P0.01，###P0.。与LPS刺激组相比，*P0.05，**P0.01，***P0.。
体内活性评价
前期研究已经初步证实了EACPA水凝胶具备慢性伤口敷料所需具备的性质。那么接下来看看体内效果如何。首先要复制糖尿病慢性伤口模型，模型对象选择C57BL/6J小鼠，通过连续向小鼠腹腔注射50mg/kg的链脲霉素（STZ）5天，以小鼠连续4周血糖≥mg/dL作为模型复制成功的标准。然后在背部复制直径为8mm的圆形全层皮肤缺损创面，阳性对照选择市售伤口敷料3M的Tegaderm敷料。敷料更换频率按照Tegaderm说明书，7天更换一次。于第三天对各组进行样品收集。第18天处死小鼠（图5a）。EAPCA水凝胶对伤口的粘合力在补充材料中已经验证，可以满足实验需要。图5b中可见未给予治疗组、Tegaderm组和EACPA组不同时间点伤口情况。可以看到两个治疗组的疗效均远远好于为治疗组，未给予治疗组的小鼠皮肤创面至第18天仍有干结痂。图5c是对伤口愈合情况进行定量分析，从中可见EACPA治疗组的效果优于Tegaderm组。第18天，未给予治疗组的小鼠皮肤创面仍有19.1%，也可说明慢性伤口的难愈合性。
对第18天取材的组织进行HE染色和MTS染色，组织学分析结果与肉眼观察结果一致。如图5d所示，Tegaderm组和未给予治疗的对照组的HE染色切片中可见残留的结痂（干燥血液、血清和渗出物的外壳），与之相较，EACPA水凝胶组中未见任何残留的结痂。未给予治疗的对照组中还可以观察到在结痂中包封的一定的死的炎症细胞，表明在伤口愈合的早期阶段出现炎症（图5d的白色虚线圈）。EACPA水凝胶和Tegaderm组都有益于缓解伤口愈合的炎症情况。在第18天，EACPA水凝胶组的肉芽组织形成更多，其比市售组较厚约μm（图5e）。此外，在EACPA水凝胶组中可以清楚地观察到其中的毛囊、皮脂腺、汗腺的管道和鳞状上皮，这些有益于伤口愈合的组织也较其他两组更多（图5d）。MTS用以检测伤口愈合面积中新生胶原蛋白的沉积（图5f）。图中可见，给药第18天后，市售Tegaderm组和EACPA水凝胶组的胶原沉积均显着高于对照组。CD31免疫荧光染色的红色部分代表创面中生成的新血管，图5g和h分别定性定量，可见在未给予治疗组中观察到的荧光很少，两组伤口敷料干预后的组别荧光强度明显增强，其中EACPA水凝胶的CD31表达量最高。
●●●图5.EACPA水凝胶糖尿病慢性伤口的治疗效率。
a）糖尿病慢性伤口的示意性建立和治疗。b）具有不同治疗的糖尿病慢性伤口的代表性照片。标尺：5毫米。c）伤口闭合率的定量分析。d）伤口组织的HE染色图。e）肉芽组织厚度的定量分析。f）伤口组织的图像。g）第18天CD31（红色）和核（蓝色）的免疫荧光染色。h）不同组CD31的相对覆盖面积。数据显示为平均值±SD（n=3）。*P0.05，**P0.01，***P0.。红色双头箭头代表肉芽组织的范围。深蓝色虚线表示肉芽组织的边界。黑色箭头代表残留的结痂。红色、绿色、黄色和蓝色箭头和白色虚线圆圈分别代表血管，皮脂腺，汗腺，毛囊，炎症细胞的管道。
M1表型的巨噬细胞会产生一系列炎性细胞因子（如IL-1β和IL-6），以致组织损伤和器官功能障碍；M2表型巨噬细胞会分泌高水平的抗炎因子（IL-4和IL-10）和生长因子（如血管内皮生长因子（VEGF），有利于新血管的生成；表皮生长因子（EGF），以减少炎症，调节肉芽形成，促进组织再生。TGF-β1作为众所周知的免疫抑制因子，可以通过诱导M2型巨噬细胞改善过度的炎症反应，并在刺激内皮细胞迁移和血管生成中起着关键作用。各组第三天取材的各指标含量测定见图6b，由图中可知，2个治疗组的IL-1β和IL-6（M1marker）含量降低，IL-4、IL-10等（M2marker）含量增加，表明在早期发生炎症时，Tegaderm和EACPA可以显著通过促进抗炎细胞因子分泌来抑制炎症反应并加速愈合过程；其中EACPA组的治疗效果较Tegaderm组还有显著性提高。
图6c通过免疫荧光染色，直观观察给药第3天皮肤组织中IL-1β的表达情况，可见EACPA水凝胶中最低荧光强度显示IL-1β的表达明显抑制。定量分析提示，未予以治疗组和Tegaderm敷料组中IL-1β的相对覆盖面积是EACPA组20和12倍（图6d）。这两种结果都与ELISA结果一致，表明EACPA水凝胶确实有效地减少了炎症。为了进一步验证EACPA水凝胶对体内巨噬细胞的转化作用，用F4/80和CD进行免疫荧光染色。如图6e所示，大多数巨噬细胞在没有处理的情况下停留在M1表型（F4/80+CD-）中，予以EACPA水凝胶治疗后，在收集的组织中可观察到M2表型巨噬细胞（F4/80+CD+）显着增加。虽然在Tegaderm组也检测到M2表型巨噬细胞的红色荧光，但其强度和相对面积远低于EACPA水凝胶敷料组。
上述结果提示，与其他对照组相比EACPA水凝胶组表现出VEGF，TGF-β1，IL-4和IL-10的表达增加，IL-1β和IL-6的表达减少，在治疗初期可促进M1型巨噬细胞向M2型转变，有益于伤口愈合。
●●●图6.EACPA水凝胶调节炎症微环境，促进慢性糖尿病伤口愈合。
a）在不同处理后第3天收集的伤口组织并进行以下测试。b）通过ELISA测定与伤口组织中与炎症和血管生成相关的趋化因子的浓度（n=3）。c）在第3天皮肤伤口组织中IL-1β（红色）和核（蓝色）的免疫荧光图像。d）IL-1β对相对覆盖面积的定量分析。e）用F4/80（红色）和CD（绿色）染色后伤口组织中巨噬细胞免疫荧光图像。用DAPI（蓝色）染色核。数据显示为平均值±SD（n=3）。*P0.05，**P0.01，***P0.。
●总结与思考●
回顾全文，作者制备了一种机械强度好、自修复力强的智能水凝胶，其具有抗菌、抗氧化、抗炎等功能，并可以促进M1型巨噬细胞转化为M2型，减少炎症反应，促进组织重塑和新血管生成，从而促进伤口愈合。
●●●EACPA治疗糖尿病C57小鼠的慢性伤口的机制
参考文献：
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指导老师：狄留庆、乔宏志
排版编辑：张新茹、陆颖颖
稿件审阅：乔宏志
高效给药
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