人体酪氨酸酶在非黑素合成系统中的表达及可

摘要

关键词：表征;表达;人体；纯化;酪氨酸酶

前言

酪氨酸酶(单酚单氧合酶，EC1.14.18.1)是一种含铜的氧化还原酶，可将单酚羟基化催化为邻二酚，并利用分子氧作为共底物将邻二酚氧化为邻苯醌(Fenolletal.,)。已发现酪氨酸酶家族存在于多种物种中，履行不同的功能。在动物体内，酪氨酸酶是黑色素生成的关键酶，可介导皮肤、眼睛和头发的色素沉着。

首先，酪氨酸酶催化的两步氧化过程，先将L-酪氨酸转化为L-多巴醌，然后进一步产生酶促反应和非酶促反应，最终导致黑色素的生成(OlivaresSolano,;KondoHearing,)。植物和真菌体内的酪氨酸酶是褐变的罪魁祸首，这是水果、蔬菜和蘑菇在处理和储存过程中不希望发生的(Parvezetal.,)。酪氨酸酶在生物传感器的开发，以及醌类、酚类化合物的立体构象合成在工业上也有应用(Sariaslani,;May,)。

最后，哺乳动物体内的酪氨酸酶由于其复杂的翻译后处理过程，成为研究蛋白质成熟的重要模型系统(Negroiuetal.,;Popescuetal.,;WangHebert,;Cioacaetal.,)。因此，酪氨酸酶及其活性调节具有极大的科学意义和经济价值(Rescignoetal.,年)。

至今为止，大多数研究都是采用商用的双孢菇酪氨酸酶进行试验(Espinetal.,;Garcia-Molinaetal.,)。最近明确了蘑菇酪氨酸酶的三维结构(Ismayaetal.,)。此外，已知了两种细菌球形双孢子链霉菌(Matobaetal.,)和巨大芽胞杆菌(Sendovskietal.,)的酪氨酸酶的X线结构。

相比之下，人体酪氨酸酶(hTyr)的动力学或结构信息很少。这主要是由于很难从自然来源或通过其他物种中表达获得足够数量的hTyr。天然跨膜蛋白的溶解性差、翻译后的异质性修饰(Ujvarietal.,)和黑色素的大量混杂进一步阻碍了从细胞提取物中纯化hTyr。虽然可以从人体黑色素瘤转移瘤中纯化出大量的hTyr(Nishioka,;YurkowLaskin,;WoodSchallreuter,)，但这是否是hTyr的原本形式尚不清楚(Hearingetal.,)。

此外，该方法显然不适合在实验室中连续生成酪氨酸酶。人体酪氨酸酶可在多种动物细胞系中短暂表达(Tripathietal.,;Olivaresetal.,;Wendt,;Schweikardtetal.,)。然而，其合成效率都很低，因此无法详细描述所得制剂的表征。在本研究中，我们建立了非黑素细胞HEK的表达系统，克服了上述几项困难。利用该系统，我们得到了野生型hTyr和一组可溶的截断的His标记的hTyr，后者易于通过金属亲和层析纯化。随后，我们进一步尝试了在乳酸克鲁维酵母菌中过表达链标记的hTyr。

结果

被截断的hTyr亚型

在瞬时转染的HEK细胞中，异源表达产生了野生型hTyr和一组不同截断型的活性hTyr。图1和表1总结了这些亚型的相关属性。结构A缺少胞质结构域，而亚型B在跨膜结构域的N端被截断。另外三个亚型(C-E)在管腔结构域的C端被分别缩短了10个、20个、30个氨基酸。

由于hTyr与已知结构的苯酚氧化酶(PDB包含1bug、1wx2和2y9w)进行序列比对表明，在hTyr中催化域的C端位于残基至之间，所以选择10个残基的截断步长。通过Westernblotting和活性测定进行检测亚型的表达(图2和图3)。值得注意的是，由于在培养基的上清液中，hTyr条带被培养基中大量的弱免疫反应性的BSA（牛血清白蛋白）所掩盖，所以图2用细胞提取物获得蛋白质印迹。

据报道，野生型酪氨酸酶(WT)可转为约70kDa大小的天然糖基化hTyr(Popescuetal.,;Cioacaetal.,)。正如预期的那样，被截断的亚型B到E的大小逐渐减小(参见图3)。残基至之间的截断并不显著影响亚型B-D的表达，而超过30个氨基酸的缩短则抑制活性酶的产生(亚型E)。这表明催化结构域中包括了多达个残基。

在细胞匀浆中发现了大部分活性亚型，包括野生型hTyr和亚型A，而在培养基中缺乏跨膜结构域(B-E)的活性亚型，表明这些蛋白被细胞有效地输出。hTyr的分泌缓解了由于细胞内黑色素的积累和活性酪氨酸酶的过表达而导致非黑色素形成细胞生长阻滞和凋亡的问题。

在我们的系统中，表达亚型B-D的细胞没有出现任何黑色素化，并且培养中存活时间明显更长。因此，可连续数天以上收集含有酪氨酸酶的上清液。

表1.本研究构建的hTyr亚型的性质

蛋白质印迹的表达水平、相对条带强度(参见图2)，SS,信号序列；Km,左旋多巴的Michaelis常数；N.D.,未确。

图1：截断的hTyr亚型的结构。野生型酪氨酸酶序列(WT)、指示信号序列(SS)、铜结合基序CuA和CuB、跨膜序列(TMD)和细胞质结构域(CD)的位置。(A)缺少CD的亚型；(B)缺少CD和TMD的亚型；(C)-(E)分别在残基、和处截断的结构。DHis，His标记的亚型D；HT，6-HisTag；DStr，Strep标记的亚型D；ST，8位氨基酸的StrepTag。表1总结了各亚型的相关特性。

图2：HTyr亚型A-E的Westernblotting分析。瞬时转染不同质粒的HEK细胞，培养3d，收集细胞并裂解。细胞总蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到Immobilon-P膜上，用Westernblotting进行分析，如方法部分所述。野生型酪氨酸酶(WT)以未转染的HEK细胞为对照(K-)。

图3：HTyr野生型(WT)和亚型A-E在HEK细胞中的表达水平，细胞裂解物中的总活性，▇培养上清液中的活性。根据样本量的不同对活动进行了校正。K组，对照组(未转染细胞培养上清)。

催化性能

在本实验条件下，根据表达的hTyr亚型类型和细胞的年龄，HEK培养上清液在左旋多巴-MBTH实验中可产生2-25mAU/min(0.5-6.5mU/ml)的最大吸收范围。为了确定其活性来源于hTyr，而不非底物和/或产物的非酶氧化，我们不仅测量了左旋多巴的活性，且由于右旋多巴的自氧化速率与左旋多巴相似，还测量了左旋多巴甲酯和右旋多巴的活性。

图4A显示了这些底物在不同培养基稀释后的反应速率。从图中可以明显发现，在这种情况下，三种底物的自氧化速率均为0.5-1mAU/min。天然培养基和1:10稀释的培养基中所有多巴衍生物生成速率明显更高，而在稀释倍的培养基中获得的吸收反应很难与非酶反应的吸收反应区分开来。

如图4B所示，野生型酶活性取决于左旋多巴的浓度。估计的Km值(约0.5mM)与文献中报道的数据具有良好一致性(WinderHarris,)。左旋多巴甲酯的最大氧化速率约为左旋多巴的60%，Km为2.9mM(数据未显示)。右旋多巴的Km值过高，无法通过MBTH法准确测定。Espin等人()和Fenoll等人()也报道了双孢蘑菇酪氨酸酶与上述底物具有类似的特异性。

为了明确hTyr序列的截断是否以及在多大程度上影响酶的催化性能，我们还对缩短的亚型进行了动力学研究。由表1可知，A、C、D亚型的Km值与野生型酪氨酸酶的Km值之间的差异并不显著，而B亚型的Km值却显著高于野生型。

图4：酪氨酸酶亚型hTyr-DHis底物氧化动力学。(A)对左旋多巴(●)、右旋多巴(?)和左旋多巴甲酯(O，均在4.8mM处)的活性(以最大吸收变化/分钟表示)随酶浓度的变化而变化。以未稀释的培养上清液(相对浓度=1)以及1：10、1：50和1：的稀释度作为酶源。(B)在pH7.0和37℃条件下，测定了左旋多巴氧化反应的动力学，每项测量3次。绘制相应的平均值和标准差与左旋多巴浓度的关系图。实线符合Michaelis-Menten方程，Vmax=15.3±0.4mAU/min，Km=0.50±0.05mM。插图中显示了每个数据点的残差(实验率减去拟合值)。

亲和性标记的hTyr亚型的表达和纯化

我们在进一步实验中，重点研究了产量最高且具有与野生型hTyr相似动力学性质的亚型hTyr-D。为了便于从培养基中分离酶，我们在亚型D的C末端用两种亲和性标记。一个不含信号肽的带链标记的亚型(hTyr-DStr)在K.lactis中高效表达并分泌。

亲和性层析所得到的蛋白产物在SDS凝胶中呈单个锐带，表观分子量在50-55kDa之间(图5a)。然而，在这些制剂中没有检测到活性酪氨酸酶。联合柱层析重折叠实验(Luoetal.,)未能获得活性酶。然而，热荧光测定(Pantolianoetal.,)得出的表观熔化温度Tm为53℃(数据未显示)，表明表达大部分蛋白被折叠。

如表1所示，在稳定转染的HEK细胞中，hTyr-DHis的表达提供了一种具有正常催化性质的酶形式。利用在Ni2+琼脂糖上的金属亲和层析技术可以便捷地从细胞培养基的上清液中分离出标记的亚型。第一步亲和力产生了超过0倍的富集(见表2)。它不仅清楚了伴随的蛋白质，而且也清除了大部分污染的黑色素，这些黑色素与HisTrap柱状物紧密结合，并且只有在高浓度咪唑的条件下才能被清除。

可能在培养基中还存在的其他抑制剂分离，第一步的亲和过程使酶的总活性显著增加。虽然第二步亲和过程并没有提高特异性活性，但有必要去除残留的黑色素，并提供一种可在4℃下保存3个月初始活性的损失不超过15%的稳定制剂。

图5B比较了纯化hTyr-DHis在SDS凝胶上的染色差异。蛋白染色(lane1)显示，在60-75kDa之间存在数个紧密的条带，且在约55kDa处存在一个较强的条带。而酪氨酸酶检测到的活性仅高于60kDa(lane2)，Westernblotting显示所有55至75kDa的条带均与抗酪氨酸酶抗体发生反应(lane3)。

总之，以上结果显示，我们的表达系统得出数个分子量约70kDa的活性形式和一个分子量约55kDa的(可能为非糖基化)无活性酪氨酸酶形式。从活性区域的凝胶切片中提取的蛋白质经质谱分析证实了这一假设。

MALDI-TOF技术非常适合分析大分子蛋白，因为它不会引起碎片化，并且产量可达几百kDa，精度为0.01%至0.1%。在图6绘制了所观察的信号强度与质量/电荷比（m/z）的关系图。光谱显示在62kDa-73kDa之间存在一条宽条带（最大分子量为67kDa，且在分子量Da时存在一个尖峰）。

分子量为29kDa和33kDa的信号并非由其他蛋白质产生，但代表了两种主要物质的双重带电(M+2H)2+形式，通常在以芥子酸为基质时出现(Gimenezetal.,)。分子量为57kDa的物质与含有信号肽和两个铜离子的hTyr-DHis的分子量基本一致(Da,参见表2)，表明该蛋白确实相当于未糖基化的hTyr。

表2.HTyr-DHis纯化表

HisTrapFF亲和层析和重层析在同一系统上进行，如材料和方法部分所述。

图5：纯化亚型hTyr-DStr和hTyr-DHis的凝胶电泳。(A)纯化的hTyr-DStr在K.lactis.中表达SDS-PAGE。M,标记蛋白；1-7,链触动蛋白洗脱物组分1-7、考马斯染色。(B)纯化的hTyr-DHis在HEK细胞中表达SDS-PAGE。M,标记蛋白。Lane1：HisTrapFF重层析后聚集的活性成分，考马斯染色；Lane2：活性染色；Lane3：Westernblot。

图6：从SDS聚丙烯酰胺凝胶中提取的纯化hTyr-DHis的MALDI-TOF质谱学(见正文)。

讨论

哺乳动物体内酪氨酸酶是一种完整的膜蛋白，在黑素体膜上成熟且其催化域面向膜内。这种拓扑结构限制了黑色素的合成进入黑素小体内，是一个潜在的毒性过程。然而，酪氨酸酶的生物合成因此成为了一个复杂的过程，包括大量的翻译后的加工和运输过程，其中许多过程的关键取决于正确的糖基化前酶(SitaramMarks,)。

目前已经证实，哺乳动物体内酪氨酸酶的第6个或第7个N-糖基化位点中的2个产生恰当的糖基化，对于活性酶的形成绝对必不可少(Branza-Nichitaetal.,;Petrescuetal.,;Popescuetal.,;Cioacaetal.,)。酪氨酸酶成熟的另一个关键环节是必须组装酶的双铜中心。尽管对哺乳动物体内酶中插入铜的机制了解甚少，但已有研究表明需要特殊的分子协同才能将铜递送至某些细菌的酪氨酸酶内。(TsaiLee,;Lopez-Serranoetal.,年)。

为了明确复杂的酪氨酸酶生物转化途径在哺乳动物和正确糖基化对折叠和活动的的重要性，由Kong等人(,)和最近Chen等人()在大肠杆菌中活性人体酪氨酸酶的表达(但显然未糖基化)。虽然目前已知革兰氏阴性细菌以糖基化的形式分泌一些毒力因子，但大肠杆菌中的糖基化似乎与哺乳动物中的糖基化有很大不同(Sherlocketal.,)，因此预计不会产生正确处理的酪氨酸酶。不幸的是，任何一组所采用的测定方法(特别是纠正底物非酶氧化的措施)都不能充分描述以评估其活性数据的重要性。

动力学参数（如Km或Ki）可与原始hTyr进行比较，但并无相关报告。在本研究中，Kong等人()发表的方案一直未能从大肠杆菌中产生活性酶(Wendt,)。

因此，我们认为，尽管酵母拥有处理哺乳动物蛋白的复杂糖基化机制，即使hTyr前体通过真核生物K.乳酸菌的分泌途径传递，也不足以产生适当的糖基化活性酶(Ganatraetal.,)。

在非黑色素性哺乳动物细胞中表达人体酪氨酸酶的尝试也遇到了各种各样的困难。首先，该酶的过度表达可导致细胞内黑色素的积累，迅速导致生长阻滞和细胞死亡，从而严重限制其表达量。

在目前的工作中，我们构建了许多不同截断的可溶性hTyr亚型，发现HEK细胞很容易分泌缺乏C端结构域和跨膜部分的酶。这些亚型的最佳长度约为个残基。一个较短的亚型(亚型E,AS)没有有效表达，而在跨膜域N端被截断的亚型B可破坏催化性能。

二级结构预测表明，hTyr的-残基形成了一个强烈的两亲性螺旋结构，在天然的hTyr中该结构可被溶剂隐藏。在亚型B中，相应的部分暴露在C端，因此可局部干扰折叠。亚型C和D缺乏这些残基，动力学表现正常。Popescu等人()也描述了类似的结果，他们报道了在跨膜序列N端被截断的hTyr亚型在ER中表现出不完全折叠、保留和降解。

当从培养基的上清液中分离出hTyr亚型时，出现了另一个问题。常见的培养基成分牛血清白蛋白(BSA)与hTyr(66kDa)质量几乎相同，因而严重干扰酶的纯化和免疫学检测。可以通过使宿主细胞适应无FCAS的合成培养基来解决该问题。然而，适应这种培养基的HEK细胞生长速度较低，仅在前2-3天内表达hTyr，大大降低了酶的产量。

为了简化纯化过程，我们延长了带有C端6-组氨酸亲和标记的hTyr亚型D的48个残基。尽管相当一部分产物似乎是由未糖基化的无活性酶组成，因此所得的蛋白质基本上是同质的(图5B)。根据分子量的增加，在63至72kDa的范围内，碳水化合物含量的变化在10%-20%，这与Nishioka()的研究结果具有良好一致性。Nishioka发现特定黑素小体酪氨酸酶的碳水化合物含量为13%，其他人报告认为经内切糖苷酶H治疗后，碳水化合物含量下降了20%-25%(Olivaresetal.,;Cioacaetal.,)。

迄今为止，几乎没有关于7mU/mg至26U/mg之间hTyr制剂的具体活性数据发表(Nishioka,;Olivaresetal.,;Kongetal.,)。然而，由于根据不同的检测程序和不同的活性单位测定具体活性，它们之间很难相互比较，也很难与我们的研究数据进行比较。在左旋多巴作用下，提纯的hTyr-DHis亚型在37℃时的特定活性约为mU/mg（参见表2）。然而，由于这类制剂中有很大一部分是无活性的57kDa蛋白，糖基化活性酶的具体活性可能更高。

材料和方法材料

质粒

营养感应蛋白激酶mTOR（抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）调节细胞的生长和代谢，雷帕霉素对其的抑制作用可以减少体内外衰老细胞的形成(Blagosklonny,)。雷帕霉素（西罗莫司）已被用于治疗面部血管纤维瘤(Wataya-Kanedaetal.,)和牛皮癣(Ormerodetal.,)。

但是，证明它对皮肤老化有益的证据还十分有限。雷帕霉素的局部治疗可以降低40岁以上人群皮肤中p16INK4A的表达，提高VII型胶原蛋白的表达并改善皮肤外表(Chungetal.,)。从它在体外的表现来看，这可能部分归因于氧化应激的调节和对成纤维细胞衰老的抑制(Qinetal.,)。

二甲双胍可延长秀丽隐杆线虫的寿命，这是由于单磷酸腺苷激酶（AMPK）的激活、对抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路的抑制(Inokietal.,)、对溶酶体通路的调节、线粒体（线粒体应激）和对微生物组的改变(Partridgeetal.,)。

它有望用于治疗包括多毛症、痤疮和化脓性汗腺炎在内的皮肤疾病(Badretal.,)，但是目前还不了解它在对抗皮肤衰老方面的潜力。在大鼠身上，局部使用二甲双胍可改善幼年动物的伤口愈合、促进胶原蛋白沉积和血管的形成，可以预防老年动物伤口愈合不良的现象，然而雷帕霉素的作用却相反(Zhaoetal.,)。在老年大鼠中，二甲双胍可以避免抑制单磷酸腺苷激酶，后者可促进伤口血管的形成，并与细胞增殖的增多和衰老标记的减少有关。

载体构建

本研究描述的所有DNA构建都是基于克隆在质粒pMEL34中的人体酪氨酸酶cDNA(Kwonetal.,)。PMEL34中的hTyr插入片段包含两个已知的多态性，即S→Y(GiebelSpritz,)和R→Q(Tripathietal.,)。匹配GenBank(Acc.No.M)中的hTyr序列，通过定点诱变，获得重组质粒pMEL34-WT。

乳酸克鲁维酵母(K.lactis)中的表达

根据说明书使用商用试剂盒(K.lactis蛋白表达试剂盒,NEB,Frankfurt,德国)的指导下，在K.lactis中表达了一种带链标记的hTyr亚型D(hTyr-DStr)。首先，用Geneart(德国雷根斯堡)将hTyrDNA序列克隆到pMA-T载体上，该序列不含N-端信号肽，但C-端含有8个氨基酸的StrepTag(hTyr-DStr)。

用XhoI/NdeI双酶切后，分离出hTyr编码片段，并将其亚克隆到pKLAC2的相应位点。产生的质粒与SacII线性化，以产生一个表达盒，可以整合到K.lactis基因组的同源重组。通过DNA测序检查所有相关质粒的正确序列。在含乙酰氨基的YCB琼脂板上测定重组酵母细胞生长的能力。重组细胞在30°C的YPGal培养基中培养一整夜以大规模表达。

HEK细胞中的表达

使用商品化试剂盒(pcDNA3.1/V5-HisTopoTA表达试剂盒，生命科技，Darmstadt，德国)，通过TOPO克隆pMEL34-WT基因片段，在HEK细胞中获得hTyr介导表达的质粒。通过相同的正向引物和不同的反向引物获得编码截短亚型A-E的插入片段，这些反向引物在不同的位点提前终止了扩增。然后根据说明书，将所得的PCR产物克隆到pcDNA3.1/V5-HisTopo载体中。

用HinDIII/NotI双酶切验证克隆片段的正确定位。为了获得His标记的亚型D(hTyr-DHis)，选择不产生终止密码子的反向PCR引物。相反，紧跟在载体His标签序列之后的终止密码子发挥作用，从而产生了一个由42个载体衍生的氨基酸和C端6个组氨酸残基组成的hTyr-D变异蛋白(见图1)。

HEK细胞常规培养于37°C、5%CO2、含10%胎牛血清、青霉素(U/ml)和链霉素(μg/ml），均由德国科尔贝PAA实验室提供)的RPMI培养基中。根据说明书，使用FuGENE?6转染试剂(德国曼海姆的罗氏诊断公司)以质粒表达瞬时转染对数生长期的HEK细胞。

为了大规模表达hTyr-DHis，用μg/ml的抗生素G培养HEK细胞，建立了稳定表达的细胞系，由于TOPO载体对G有抗性，因此本过程将选择DNA基因片段中已整合有该质粒的细胞。在μg/mlG条件下永久培养重组细胞。

纯化过程

根据说明书使用Strep-Tactin?系统(IBA，德国哥廷根)，通过亲和层析从K.lactis培养基中分离出亚型hTyr-DStr。酶样品在50mMTris/HCl，pH8.0的条件下应用于列，在相同缓冲液中用2.5mM的脱硫生物素洗脱。

用Ni2+琼脂糖亲和层析法从稳定转染的HEK细胞培养上清液中提纯hTyr-DHis亚型。将最多1ml的上清液用于5个的5ml-HisTrapTMFF粗柱(GE医疗，München，德国)。用20mM咪唑洗脱后，FF粗柱被mM咪唑洗脱。

收集活性部位，经PD-10柱的凝胶过滤，介质换为PBS(10mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，含mMNaCl)。所得溶液在HisTrapFF原液上进行了重新层析。这一次，通过从0到mM梯度的咪唑洗脱。用AmiconUltra-30K离心过滤单元(MerckMillipore,Billerica,MA,USA)浓缩最具活性的组分，并对其蛋白质和活性进行分析。

酪氨酸酶测定

用硫酸铵沉淀总蛋白，在PD-10柱上脱盐，制备活性测定用的中试样品。用2%TritonX-PBS缓冲液超声洗涤细胞颗粒，离心除去细胞碎屑，得到细胞提取物。以左旋多巴为底物，改进Winder和Harris()的方法，在37℃下常规测定hTyr的二酚酶活性。将含有10%(v/v)二甲基亚砜、不同浓度底物(0.3~6mm)和6mMMBTH的μm反应混合物与空白对照一起放入m磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。

在37°C平衡后，加入50μl的酶溶液开始反应，然后在ELXIU读取器(Bio-TekInstruments,VT,Winooski,USA)中监测10-20分钟。每隔15s读取每孔在或nm处的吸收值，并以数字形式存储以便后续评估。

在酪氨酸酶测定中，对于底物和产物的非酶氧化，适当的空白是绝对必要的。由于自氧化速率取决于浓度，所以在每个底物浓度下进行三个空白对照(含有缓冲液而非酶)。对空白组中的最大吸收变化率取平均值，并在动力学分析之前从含酶组的相应值中减去所得的平均值。

为了计算具体活性，MBTH与左旋和右旋多巴醌加合物的摩尔吸收系数为l/(mol·cm)，而氧化左旋多巴酯加合物的摩尔吸收系数为5l/(mol·cm)(Espinetal.,)。酪氨酸酶活性单位定义为在上述条件下每分钟形成1μmol加合物的的酶含量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹

将处理过的细胞提取物或上清液加热到95°C维持5分钟，去除样品缓冲液，然后将它们添加到凝胶上，而用于活性染色的样品则在室温下预先孵育在非还原样品缓冲液中。使用标准程序，采用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行染色。

由于hTyr对SDS具有抗性(YurkowLaskin,)，可以通过SDS凝胶活性染色检测活性酶带。为此，在7.5mM的左旋多巴和6mMMBTH的混合物中，在pH7.0的磷酸盐缓冲液中孵育凝胶或凝胶切片5-15分钟。

加入冰醋酸终止反应后，切片再用考马斯亮蓝R染色进行Westernblotting，将分离出的蛋白电印迹到Immobilon-P膜(Merck-MilliPole)上，并与抗酪氨酸酶的单抗T(抗体Ab，Abcam，美国马萨诸塞州剑桥)孵育。通过增强化学发光检测(ECL,GE医疗)定位免疫反应。使用ImageJ软件对薄膜上条带强度进行定量测定(Schneideretal.,)。

质谱学

按照JinManabe()的方法从凝胶切片中提取蛋白质样品，并用反相微柱脱盐。以芥子酸为基质，在Ultraflex-MALDI-TOF光谱仪(Bruker,Karlsruhe,德国)上对所得提取物进行MALDI-TOF质谱分析。

感谢

我们感谢马尔堡大学化学系的U.Linne博士进行了质谱分析，并感谢Marburg大学药剂系的M.Petersen博士对K.lactis表达系统的帮助。

年10月12日收稿；年12月4日录用；年12月13日在线发表。

参考文献

1.Branza-Nichita,N.,Petrescu,A.J.,Dwek,R.A.,Wormald,M.R.,Platt,F.M.,andPetrescu,S.M.().Tyrosinasefoldingandcopperloadinginvivo:acrucialroleforcalnexinandα-glucosidaseII.Biochem.Biophys.Res.Commun.,–.

2.Chen,G.H.,Chen,W.M.,Huang,Y.C.,andJiang,S.T.().Expressionofre

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