研究背景
17年来，陆续出现的SARS-COV、MERS-COV、SARS-COV-2等病毒突破了物种屏障，给人类带来了新的传染病和社会恐慌。所有这些高致病性冠状病毒均可导致急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，感染该病毒的病人可能因严重的免疫损伤而发展为非典型肺炎。过度的免疫反应导致了SARS-COV、MERS-COV和SARS-COV-2感染后的发病甚至死亡，但其机制尚不十分清楚。该文章的研究者们发现，SARS-COV、MERS-COV和SARS-COV-2的N蛋白与补体激活凝集素途径中的关键丝氨酸蛋白酶MASP-2结合，导致补体异常活化，加重炎性肺损伤。无论是阻断N蛋白与MASP-2的相互作用，还是抑制补体活化，都能在体内外显著减轻N蛋白诱导的补体过度活化和肺损伤。COVID-19患者补体过度激活，在恶化患者使用抗C5a单克隆抗体治疗时，可观察到有希望的抑制作用。补体抑制可能是这些高致病性冠状病毒引起的肺炎的常用治疗方法。
Result1SARS-COV、SARS-COV-2和MERS-COV的N蛋白与MASP-2相互作用
为了研究sars冠状病毒N蛋白与MASP-2蛋白之间的结合，并确定这两种蛋白之间的相互作用结构域，人类T细胞表达标记全长MASP-2的裂解物，N端cub1-egf-cub2区，或c端ccp1-ccp1-sp区用抗标记抗体偶联琼脂糖珠接种抗标记免疫沉淀法。然后将这些免疫沉淀与T细胞裂解物孵育，这些裂解物表达带有GFP标记的SARS-COVN蛋白(GFP-SARSN)或截短突变体，并在2mMCacl2或1mMEDTA的存在下孵育。(图2)
用抗标记抗体或抗GFP抗体对吸附物进行免疫印迹检测。只有在存在Cacl2的情况下，才能观察到Flag-MASP-2和GFP-SARSN蛋白之间的关联，符合MASP-2-MBL结合和MASP-2自激活的ca2+要求。MASP-2的ccp1-ccp2-sp区域和N蛋白的N端结构域(残基1-)是关键因素，而阴性对照或其他截短区不结合，GFP标记的全长或截短N蛋白不与小鼠IgG结合珠共免疫沉淀(图3).
SARS-COVN蛋白可在症状出现后1天即在患者血清中检测到。为了模拟血清中SARS-COVN蛋白的相关性，我们将标记过的N蛋白(1ng/ml)加入人或小鼠血清中，用抗标记抗体偶联的琼脂糖珠沉淀。SARS-COVN蛋白与人血清和小鼠血清中的MASP-2相互作用。进一步的截断和缺失分析表明，位于
SARS-COVN蛋白螺旋基序(-残基)中的-氨基酸残基是与MASP-2相互作用不可或缺的。然而，未能形成N蛋白二聚体的突变体SARS-COVNΔ-与MASP-2的关联(图S1C)没有受到太大影响(图4)。
SARS-COVN蛋白中与MASP2相互作用的关键基序(残基-)与SRAS-COV-2N蛋白(残基-)和MERS-COVN蛋白(残基-)具有高度的同源性，这说明SRAS-COV-2和MERS-COV的N蛋白也会与MASP-2相互作用。果然，外源表达的MERS-COVN和SRAS-COV-2N都与MASP-2有关，MERS-COVN的Δ-缺失突变体表现出预测的关联减少。因此，冠状病毒N蛋白的一个共同基序对于MASP-2的结合非常重要(图5、6)。
Result2SARS-COV、MERS-COV和SRAS-COV-2的N蛋白增强了MASP-2依赖的补体激活
MASP-2的ccp1-ccp2-sp结构域负责自我激活和底物结合活性，这反过来介导补体凝集素途径的激活。上述MASP-2与N蛋白的结合表明SRAS冠状病毒N蛋白可调节MASP-2的二聚化、活化和裂解。为了证明MASP-2二聚化，在N蛋白和MBL缺失/存在的情况下，将表达MASP-2-myc的T细胞裂解液和MASP-2-标记结合的珠子共同孵育。MASP-2-myc与MASP-2-flag的结合被SRAS-COVN蛋白增强，其摩尔化学计量比大致相等(图7)。
其次，纯化的MASP-2-flag与甘露聚糖和MBL孵育，变量为加入或不加入SRAS冠状病毒N蛋白。在存在SRAS-COVN蛋白的情况下，MASP-2自激活产生的裂解的MASP-2片段(残基-)水平升高(图8)。
为了研究SRAS-COVN蛋白对MASP-2结合MBL能力的影响，将纯化的MBL和MASP-2分别置于4℃的甘露聚糖包被的微孔板中孵育，以避免MASP-2激活，并用抗MASP-2抗体评价MASP-2:MBL结合的动力学。与作为N蛋白阴性对照的结合缓冲液中的高浓度组分人血清白蛋白(HSA)相比，在较低浓度(1%~0.1%MASP-2)和ca2+条件下，MASP-2与MBL的结合显著增强，抗N蛋白抗体能有效地抑制这种增强作用(图9)。
此外，与全长的SRAS-COVN蛋白相比，Δ-或Δ-缺失的SRAS-COVN蛋白或具有较低致病性的人冠状病毒E-COV中N蛋白对MASP-2:MBL的结合几乎没有影响。这些结果表明，SRAS-COVN蛋白增强的MASP-2活化不仅依赖于MASP-2的结合，还依赖于N蛋白的二聚作用。
MASP-2切割补体C4和C2激活后通过补体系统的凝集素途径产生C3转化酶。其次，用C4裂解法评估SRAS冠状病毒核蛋白对脂蛋白补体活化的影响。纯化的C4蛋白与MASP-2、甘露聚糖和MBL在有/无相等摩尔N蛋白的情况下孵育，在有甘露聚糖和MBL的情况下，观察到C4蛋白被SRAS-COVN蛋白切割程度显著增强。因此，SRAS-COVN蛋白的突变体（Δ-和Δ-）以及来自HE-COV的N蛋白不能促进MASP-2介导的C4水解（图10）。
值得注意的是，抗MASP-2单克隆抗体或C1INH（MASP-2的抑制剂）阻断了SRAS-COV增强的C4水解，表明N蛋白增强的C4裂解依赖于MASP-2的激活。此外，MERS-COVN蛋白也被发现具有增强C4裂解的作用，这些结果表明，N蛋白促进C4蛋白的裂解，从而通过MASP-2的联合和激活来激活补体（图11）。
通过补体沉积测定进一步研究了SRAS-COVN蛋白对通过凝集素途径的补体激活的影响。在指定的N蛋白存在下，将纯化的C4与固定的MBL-MASP-2复合物孵育。SRAS-COV，MERS-COV和SRAS-COV-2的N蛋白而非HE-COVN增强的C4b沉积，其以剂量依赖的方式依赖于MASP-2的活性（图12）。
然后，在没有SRAS-COVN蛋白的情况下，将固定化的甘露聚糖与去C1q的血清孵育(以消除经典途径)，用抗活化的C3抗体检测沉积的C3片段(C3b、iC3b和C3dg)。与C4b沉积相一致，随着SRAS-COVN蛋白水平的增加，活化的C3的沉积明显增加，最高可达40nM，说明C3转化酶活性增强。
此外，在含EGTA的无钙缓冲液中，SRAS-COVN蛋白对活化的C3沉积几乎没有影响，说明SRAS-COVN蛋白增强的C3活化是通过LP而不是AP途径发生的，其中C3的活化是不依赖于Ca2+的。
Result3SRAS-COV和MERS-COV的N蛋白通过参与MASP-2的补体激活而加重LPS诱导的肺炎
补体的持续激活会导致无法控制的炎症。为了研究N蛋白增强的MASP-2激活对炎症反应的影响，作者用表达SRAS-COVN(Ad-SRASN)的腺病毒(1×PFU)或其突变体或腺病毒载体(Ad-Null)对小鼠进行预感染。然后用含有MBL结合基序的LPS激活LP途径并诱导炎症。10只预先暴露于腺病毒载体的小鼠中，有8只在注射5mg/kgLPS后存活，而10只预先暴露于Ad-SRASN的小鼠均在给予相同剂量的LPS后12小时内死亡(图13)。
在死亡小鼠中也观察到严重的肺损伤和大量的炎性细胞浸润。与之前的研究结果一致，Δ-或Δ-缺失的Ad-EN和Ad-SRASN预感染显著降低了对小鼠死亡率的影响。重要的是，在Ad-SRASN预感染小鼠中，当抗N、抗MASP-2抗体或C1INH与LPS给药同时进行时，LPS诱导的死亡率和肺组织炎症均显著降低(图3A和图3B)。这些结果共同证明了SRAS-COVN蛋白通过激活MASP-2大大增强了脂多糖诱导的炎症反应，从而启动了脂多糖参与的补体级联激活(图14)。
为了研究LPS和N蛋白诱导的小鼠肺补体活化，作者用LPS(5mg/kg)对Ad-SRASN(1×PFU)预感染小鼠的肺补体活化进行了研究。LPS给药6小时后处死小鼠，用多聚甲醛固定的肺组织进行免疫组织化学(IHC)染色，抗C4b抗体或fitc标记的抗C3c抗体进行免疫荧光分析。相比于脂多糖和Ad-Null弱染色的小鼠肺组织，表达SRAS-COVN蛋白的小鼠肺组织C4b和活化C3沉积明显增加(图15、16)。
用邻位连接技术(PLA)结合抗N和抗MASP-2抗体进一步评价MASP-2与N蛋白的体内相关性，并在表达SRAS-COVN的小鼠肺细胞中大量观察到红色信号(只有当SRAS-COVN和MASP-2相互结合时才能检测到红色信号)（图17).这些结果证实了MASP-2在小鼠肺组织中的原位直接结合和激活。
同样地，被LPS攻击的小鼠在预先感染表达MERS-COVN蛋白的腺病毒(Ad-MERS-COVN)后24小时内死亡率为%，而其Δ-突变体(Ad-MERSNΔ-)在7d内未死亡，该突变体被C1INH和抗MASP-2抗体部分挽救(图18)。这些结果表明N蛋白通过MASP-2介导的凝集素途径被SRAS冠状病毒和MERS-COV病毒利用来促进补体的活化。
利用MASP-2蛋白酶活性缺失的MASP2敲除(KO)小鼠进一步研究N蛋白的致病性。小鼠用Ad-SRASN或Ad-MERSN(1×PFU)预感染5天，然后用LPS处理。与野生型小鼠相比，MASP2KO小鼠存活时间更长，存活率更高(图19)，这可能是由于MASP-2缺失导致补体激活受损所致。
Result4COVID-19感染患者肺部补体级联反应过度激活
由于SRAS冠状病毒和SRAS冠状病毒2型对小鼠只造成轻微的肺损伤，国内有关规定不允许活体冠状病毒研究，包括小鼠适应性SRAS冠状病毒研究，笔者试图找到补体LP通路过度激活的临床证据。收集COVID-19死亡病人的多聚甲醛固定肺组织，用MBL、MASP-2、C4alpha、C3或C5b-9抗体进行IHC染色。所有这些补体级联成分在患者肺组织中均显示强烈的IHC染色信号(图20、21)，提示补体成分沉积于i型和ii型肺泡上皮细胞，以及炎性细胞、一些增生性肺泡细胞和肺泡腔渗出物中，并伴有坏死细胞碎片。
值得注意的是，通过尸检，死亡患者的肺组织中也发现了SRAS-COV-2N蛋白。此外,COVID-19患者的血清C5a水平也显著升高，尤其是严重病例(图22)。这些结果表明，COVID-19患者肺内补体通路被极大程度激活，这可能与SRAS-COV-2N蛋白有关。
Result5补体靶向治疗对COVID-19患者显示很好的疗效
基于以上发现及其在COVID-19患者治疗中的潜在和诱人应用，一种重组的C5a抗体(bdb-注射用staidson生物制药公司)，在用于化脓性汗腺炎的ii期临床试验中，迅速得到国家医药产品管理局(NMDA)的批准，用于治疗COVID-19的ii期临床试验(L)。在获得患者知情同意的情况下，医院伦理委员会批准，对轻度COVID-19患者同时进行多中心、随机双盲安慰剂对照试验，对重度和危重COVID-19患者同时进行开放标签双队列临床试验。虽然COVID-19队列中更多患者的更大数据集将在试验结束后在其他地方报告，但在这里，笔者报告了开放标签试验中使用抗C5a抗体的前2例(具体见文章)。
这些数据为C5a在COVID-19严重感染患者中的损伤作用提供了第一个证据。2例重症患者抗C5a单克隆抗体治疗明显获益，提示异常补体级联应作为COVID-19有希望的治疗靶点。
总结：
作者最后表明，SRAS-COV、MERS-COV和SRAS-COV-2共同的机制：将病毒N蛋白与MBL、ca2+依赖的MASP-2的自激活结合和增强联系起来，导致补体级联失控的激活。N蛋白与MASP-2的结合增强了MASP-2介导的凝集素途径的激活作用。N蛋白突变体不能与MASP-2相互作用或不能形成N二聚体，对MASP-2介导的凝集素途径的激活作用很小或没有影响，表明N蛋白的作用依赖于结合和二聚化。
读者感悟：
N蛋白介导的MASP-2的参与，以及补体级联过度激活在冠状病毒发病机制中的作用，为开发抗SRAS-COV、MERS-COV或最新的SRAS-COV-2的疗法提供了新的潜在策略。这类高致病性冠状病毒已困扰人类几十年之久，而今发现对抗新冠肺炎新的有效的治疗方法更是迫在眉睫，本文研究者们结合了实验室与临床数据，有望带来新的福音。
本文于年3月30号在线发表于医学预印本期刊Medrixv
高婷为第一作者，军事医学科学院曹诚教授、刘璇教授及陆军军医大学毛青教授为共同通讯作者
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